การผลิตและการศึกษาคุณสมบัติของเชื้อ Burkholderia pseudomallei ที่มีการกลายพันธุ์ของจีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ไบโอฟิล์ม โดยวิธี transposon mutage

การผลิตและการศึกษาคุณสมบัติของเชื้อ Burkholderia pseudomallei ที่มีการกลายพันธุ์ของจีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ไบโอฟิล์ม โดยวิธี transposon mutagenesis

Construction and characterization of biofilm mutants of Burkholderia pseudomallei with transposon Tn5-OT182 mutagenesis

จิรารัตน์ สองสี (Jirarat Songsri) ^*

ดร. ปรีชา หอมจำปา (Dr. Preecha Homchampa) ^**

ดร. ธนกร ปรุงวิทยา (Dr. Tanakorn Proungvitaya)^***

บทคัดย่อ

โรคเมลิออยโดสิส (melioidosis) เป็นโรคติดเชื้อจากแบคทีเรีย Burkholderia pseudomallei ทำให้เกิดการติดเชื้อที่รุนแรงทั้งในคนและสัตว์และก่อให้เกิดอัตราการตายสูง โรคนี้มีอุบัติการณ์สูงในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้และทางตอนเหนือของประเทศออสเตรเลีย ปัจจุบันยังไม่มีวัคซีนที่มีประสิทธิภาพสำหรับโรคนี้ เนื่องจากเชื้อ B. pseudomallei สามารถสร้างไบโอฟิล์ม (biofilm) ได้ และมีรายงานว่าไบโอฟิล์มที่เชื้อสร้างขึ้นนี้ ทำให้มันสามารถดื้อต่อการรักษาด้วยยา ceftazidime และ cotrimoxazole นอกจากนี้ในปัจจุบันยังมีการศึกษาเกี่ยวกับจีนที่เกี่ยวข้องในการสังเคราะห์ไบโอฟิล์มของเชื้อแบคทีเรียชนิดนี้อยู่น้อย ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์ เพื่อผลิตเชื้อ B. pseudomallei ที่มีการกลายพันธุ์ของจีนที่เกี่ยวข้องในการสังเคราะห์ไบโอฟิล์มด้วยวิธี transposon mutagenesis โดยทำการตรวจกรองการสร้าง ไบโอฟิล์มของเชื้อ transposon mutant จำนวน 3,315 ตัวอย่าง โดยวิธี tube test และ microtiter-plate test ผลการศึกษาพบเชื้อที่มีการกลายพันธุ์ของจีนที่เกี่ยวข้องในการสังเคราะห์ไบโอฟิล์มจำนวน 12 ตัวอย่าง เมื่อศึกษาลำดับ นิวคลีโอไทด์บริเวณด้านข้างที่ transposon เข้าไปแทรกโดยวิธี cloning และ DNA sequencing พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณด้านข้างที่ transposon เข้าไปแทรกของเชื้อ B. pseudomallei ที่มีการกลายพันธุ์จำนวน 6 ตัวอย่าง มีความคล้ายคลึงกับจีนที่เกี่ยวข้องกับ putative transport related membrane protein, putative Rhs-related membrane protein, putative OmpW-family exported protein, putative methylase, flagellar based-body rod protein and flagellar L-ring protein precursor และ putative lipoprotein ดังนั้นในการสังเคราะห์ไบโอฟิล์มของเชื้อ B. pseudomallei มีจีนที่เกี่ยวข้องหลายชนิด โดยอย่างน้อยที่สุดมี 6 จีนดังที่กล่าวมาข้างต้น ข้อมูลที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้นอกจากจะทำให้เราทราบจีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ไบโอฟิล์มของเชื้อ B. pseudomallei แล้วยังเป็นข้อมูลที่จะมีประโยชน์ในการพัฒนาสารบางชนิดที่มีผลในการป้องกันการสร้างไบโอฟิล์มของเชื้อ B. pseudomallei ได้

คำสำคัญ: ไบโอฟิล์ม, โรคเมลิออยโดสิส, Burkholderia pseudomallei

Key words: Biofilm, Melioidosis, Burkholderia pseudomallei

* นักศึกษาปริญญาเอก หลักสูตรปรัชญาดุษฎีบัณฑิต สาขาวิชาชีวเวชศาสตร์ คณะบัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยขอนแก่น

** ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ภาควิชาภูมิคุ้มกันวิทยาคลินิก คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น

*** อาจารย์ ภาควิชาภูมิคุ้มกันวิทยาคลินิก คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น

Abstract

Burkholderia pseudomallei is a bacterial pathogen causing the melioidosis, a severe disease of humans and animals. This disease is predominantly found in tropical areas of Southeast Asia and Northern Australia. At present there is no effective vaccine against B. pseudomallei infection. B. pseudomallei has been reported to produce biofilm and B. pseudomallei biofilm cells were found to be resistant to ceftazidime and cotrimoxazole. Currently little is known about the gene involved in biofilm formation in this organism. The aim of this study is to construct biofilm mutants of B. pseudomallei using transposon mutagenesis in order to characterize gene(s) involved in biofilm production. Three thousand three hundred and fifteen transposon muants were screened for loss of biofilm production using tube test and microtiter-plate test. Twelve stable biofilm mutants were isolated. DNA flanking transposon insertion in each of the 12 biofilm mutants was cloned, sequenced, and analyzed by bioinformatics tools. The flanking sequences from 6 biofilm mutants show homology with putative transport related membrane protein, putative Rhs-related membrane protein, putative OmpW-family exported protein, putative methylase, flagellar based-body rod protein and flagellar L-ring protein precursor, and putative lipoprotein. Therefore, the biofilm formation of B. pseudomallei requires multiple genes, and at least six genes are involved in biofilm formation of B. pseudomallei. Characterization of biofilm mutants in a mouse model is ongoing. This knowledge will be useful for

development of therapeutic agents that prevent the formation of biofilms.

จากการประชุมทางวิชาการ เสนอผลงานวิจัย ระดับบัณฑิตศึกษา ครั้งที่ 9
วันศุกร์ที่ 19 มกราคม 2550 ณ มหาวิทยาลัยขอนแก่น
The 9^th Symposium on Graduate Research, KKU. 19 January 2007